Resumen

El principal objetivo de esta línea de investigación es el desarrollo de nuevos tratamientos y de diagnóstico, basadas en los mecanismos de captación del Fe(III), contra las enfermedades infecciosas en peces de acuicultura provocadas por bacterias patógenas Gram negativas.

Nuestra aproximación consiste en aprovechar los mecanismos bacterianos de captación del hierro(III), elemento esencial para su crecimiento y desarrollo pero que posee una disponibilidad muy limitada debido a su baja solubilidad a pH fisiológico, basado en el empleo de sideróforos. Estos son compuestos de bajo peso molecular que al ser secretados al medio que los rodea, quelatan eficazmente al hierro(III) y luego lo transportan de manera específica a través de receptores proteicos específicos de membranas al interior de las células donde lo liberan.

Nuestro trabajo implica en primer lugar el aislamiento, caracterización estructural y íntesis de los siderofóros, y algunos de sus análogos, responsables de la captación de Fe³⁺ en cada bacteria patógena. Adicionalmente, se estudia la biosíntesis de los sideróforos aislados con la identificación de los genes implicados así como el ensamblaje de los mismo, y de las proteínas no solo implicadas en la biosíntesis sino también en la recepción y transporte del complejo férrico del sideróforo. Las principales aplicaciones biotecnológicas a desarrollar con este conocimiento adquirido se centran en:

• el desarrollo de nuevos antimicrobianos mediante la conjugación del análogo de sideróforo con un antibiótico conocido (estrategia del Caballo de Troya)

• la preparación de sondas fluorescentes como nuevas herramientas de diagnostico con su conjugación con un fluoróforo conocido.

• el desarrollo de nuevas vacunas empleando las proteína de membrana externa del complejo sideróforo-hierro (III) como antígenos. Para conocer en mas detalle esta aplicación ver línea de investigación titulada PRODUCCIÓN Y AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Estamos investigando tres de las más importantes enfermedades infecciones en acuicultura: vibriosis, fotobacteriosis (pasteurellosis) y forunculosis, causadas por las tres patógenas Gram negativas: Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae subsp. piscicida y Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida, respectivamente.

Vibriosis

Causada por bacterias marinas pertenecientes a Vibrio anguillarum (Va), hemos logrado aislar y caracterizar dos de los tres sistemas de transporte de hierro de esta bacteria que fueron denominados vanchrobactina y piscibactina (el minoritario sistema anguibactina fue descrito varios años antes y solo lo poseen las cepas de Va serotipo O1 que posee el plásmido pJM1).

Sistema de transporte vanchrobactina: Aislamos y caracterizamos este sideróforo por primera vez de la cepa Va RV22 serotipo O2. Se logró su síntesis total y la de varios análogos activos que fueron empleados en la preparación de nuevos agentes antimicrobianos siguiendo la denominada estrategia de Caballo de Troya. Dichos estudios permitieron identificar a FvtA como la proteína transportadora del complejo férrico de vanchrobactina. Se estudiaron sus complejos de hierro mediante métodos espectrofotométricos y potenciométricos.

Sistema de transporte piscibactina: Se aisló e identificó previamente de Photobacterium damselae subsp. piscicida pero posteriormente se encontró que estaba ampliamente distribuido en bacterias de la familia de las Vibrionaceas. Estudios adicionales en Vibrio anguillarum mostraron que piscibactina contribuía en mayor medida que vanchrobactina a la virulencia de la infección bacteriana en lenguado. Mas recientemente, hemos aislado e identificado en Va RV22 la presencia de photoxenobactina E que posee una función de acido tiocarboxílico terminal y hemos demostrado que su complejo de galio se encuentra en equilibrio entre sus dos formas tautoméricas donde el Ga³⁺ esta coordinado a través del átomo de azufre o de oxígeno de grupo tiocarboxilato.

Fotobacteriosis (pasteurellosis)

Mediante análisis del clúster genético implicado en la biosíntesis del sideróforo biosintetizado por Photobacterium damselae subsp. piscicida, responsable de la fotobacteriosis, se logró la predicción y posterior aislamiento y caracterización estructural de piscibactina, así como la de prepiscibactina como un intermedio involucrado en su biosíntesis. Se propuso una posible ruta biosintética que relaciona la estructura deducida con los genes y enzimas implicados en su ensamblaje. Se llevó cabo la síntesis total de prepiscibactina y de piscibactina. La síntesis de diversos análogos de piscibactina permitió establecer la importancia de la configuración del grupo hidroxilo en la posición C13 tanto para poder quelatar hierro o galio como en la presencia de la actividad siderófora.

Se logró identificar FrpA como la proteína de membrana externa transportadora del complejo férrico de piscibactina. Su posterior clonaje, expresión y purificación, en E. coli permitió obtener la rFrpA que fue ensayada exitosamente como vacuna frente a la photobacteriosis, realizándose una aproximación a su estructura tridimensional por difracción de rayos X de sus cristales.

La transmisión del plásmido pPHDP70, que codifica la biosíntesis de piscibactina, por conjugación des P. damselae subsp. piscicida a una cepa mutante de la bacteria Gram-negativa patógena de molusco, Vibrio alginolyticus, a la que se le había eliminado su capacidad de producir su sideróforo vibrioferrina, permitió no solo restaurar el crecimiento la cepa mutante de V. alginolyticus en condiciones decientes de hierro, sino también detectar la producción de piscibactina. La transferencia horizontal del plásmido pPHDP70 demuestra la facilidad con la que se puede transmitir nuevos mecanismos de captación de hierro entre bacterias, con el consiguiente resurgimiento de nuevos patógenos en el medio marino.

Forunculosis

Mediante “genome mining”·del genoma de una cepa de  Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida, agente causante de esta enfermedad infecciosa, se logró identificar dos tipos de clúster de genes implicados en la biosíntesis de dos clases de sideróforos distintos. Este análisis permitió primero predecir y posteriormente aislar y caracterizar estructuralmente los dos sistemas de transporte de esta bacteria: las amonabactinas y la acinetobactina.

Sistema de transporte acinetobactina: Este compuesto fue previamente identificado como el sideróforo implicado en la captación de Fe(III) de la bacteria patógena en humanos Acinetobacter baumanii. La síntesis total del enantiómero de acinetobactina así como de diversos análogos permitieron no solo deducir importantes relaciones de estructura-actividad siderófora sino también identificar un análogo simplificado que puede ser utilizado como vector en la preparación de conjugados. Dichos estudios permitieron además identificar FstA como la proteína transportadora del complejo férrico de acinetobactina.

Sistema de transporte amonabactina: Se aislaron e identificaron las cuatro formas de amonabactinas que habían sido previamente identificadas como los sideróforos implicados en la captación de Fe(III) de la bacteria patógena en humanos Aeromonas hydrophila. Diseñamos una síntesis total más eficiente de este tipo de sideróforos. La preparación y ensayo biológico de diversos derivados de las amonabactinas nos permitió identificar un análogo simplificado que pudo ser utilizado como vector en la preparación de conjugados. Este análogo simplificado de las amonabactinas fue empleado como vector para preparar una sonda fluorescente con el fluoróforo sulforhodamine B. Dicha sonda también se utilizó para determinar la vía de entrada de Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida marcada con dicha sonda en el pez cebra. Dichos estudios permitieron además identificar a FstC como la proteína receptora del amonabactinas cuya proteína recombinante rFstC fue producida y ensayada como vacuna frente a la forunculosis.

Adicionalmente hemos estudiado los sistemas de captación de hierro mediado por sideróforos de otras bacterias patógenas: Vibrioferrina en Edwardsiella tarda agente responsable de la edwardsielosis, acinteobactina y fimsbactinas en Acinetobacter baumanii, citrato y vibrioferrina en Photobacterium damselae subsp. damselae, amphibactinas y piscibactina en Vibrio neptunius.